Adolescent, Jalil Lespert accompagne son père Jean, comédien de théâtre, à un casting : l'un et l'autre sont engagés, car le réalisateur Laurent Cantet recherche deux acteurs pour interpréter un père et son fils dans son court-métrage Jeux de plage (1995). Laissant de côté des études de droit, Lespert décroche en 1999 son premier rôle dans un long-métrage (Nos vies heureuses, le film-fleuve de Jacques Maillot), et reçoit un prix d'interprétation à Clermont-Ferrand pour ses prestations dans deux courts, dont l'un est signé Pierre-Erwan Guillaume, cinéaste qu'il retrouvera en 2004 (L' Ennemi naturel).

En 2000, c'est encore grâce à Laurent Cantet que Jalil Lespert accède à la notoriété : dans Ressources humaines, premier long-métrage du cinéaste, il est Frank, étudiant en école de commerce venu faire un stage dans l'usine où travaille son père. Seul acteur professionnel de la distribution, il livre une performance intense qui lui vaudra le César du Meilleur espoir masculin. Sorti quelques semaines après le film de Cantet, Un dérangement considérable, dans lequel il campe un aspirant footballeur amoureux de la mère de son meilleur ami, vient confirmer le talent et la sensibilité du comédien.

Jalil Lespert enchaîne alors les tournages, affichant une prédilection pour les rôles de composition. Sensuel jardinier (Sade), paumé obsédé par le culturisme (Vivre me tue), et plus tard boxeur (Virgil), l'acteur d'origine franco-algérienne incarne un émigré Italien fuyant le fascisme dans Bella Ciao. Resnais lui confie en 2003 un personnage de gigolo - dont le modèle est l'acteur Charlie Chase -, dans son opérette Pas sur la bouche, et Robert Guédiguian dirige l'acteur deux fois, lui offrant en 2005 le rôle d'un journaliste inspiré par Georges-Marc Benamou dans Le Promeneur du Champ de Mars, récit des dernières années de la vie de François Mitterrand, et en 2006 un rôle secondaire dans le drame sur le retour aux sources Le Voyage en Arménie.

Après avoir été Le Petit lieutenant sacrifié pour Xavier Beauvois, Jalil Lespert réalise son premier long métrage en 2007, 24 mesures, film-puzzle présenté à Venise. Il enchaîne en 2009 deux grands rôles, d'abord dans Lignes de front, où il interprète le personnage principal, un journaliste au Rwanda, et ensuite dans la série télévisée Pigalle, la nuit. En 2011, il tourne avec le cinéaste chinois Lou Ye dans Love and Bruises et reprend la réalisation avec un deuxième long-métrage, le drame Des vents contraires, l'opportunité d'offrir encore une fois le personnage principal à Benoît Magimel, après 24 mesures. Il enchaîne rapidement avec la mise en scène du biopic Yves Saint-Laurent avec Pierre Niney dans le rôle-titre.

En 2014, Jalil Lespert utilise sa carrure massive pour se glisser dans la peau d'un légionnaire déserteur dans le film de gangsters De guerre lasse puis campe l'année suivante le fils du viticulteur Gérard Lanvin dans Premiers crus. Il revient ensuite à la mise en scène avec le thriller Iris dans lequel il incarne un riche banquier dont la femme (Charlotte Le Bon) disparaît. Romain Duris y joue un mécanicien endetté suspecté de l'avoir enlevée.